从全血中提取细胞样本是一个常用的实验技术手段,因为这类样本能模拟人体或动物的真实细胞环境。相对于下游的实验例如药物筛选、功能研究等会比单纯的细胞系会有更好的实验效果。
从血液中提取细胞最重要的一步就是去除红细胞。以成年人外周血为例,其各种细胞的数量及比例如下
表所示:
红细胞 白细胞 血小板
含量
(个/L) (4.0-5.5)×1012 (4.0-10.0)×109 (1.0-3.0)×1011
中性粒细胞 淋巴细胞 单核细胞
占比 50%-70% 20%-40% 3%-8%
红细胞数量巨多,为了下游实验能制备好的细胞样本必须去除红细胞。目前常用去除红细胞有以下几个方法:
1.氯化铵裂解法:
它既不损伤有核细胞又能充分的去除红细胞。这种方法简单易行且比较温和的红细胞去除方法,主要用于经酶消化分散的组织细胞的分离纯化,淋巴细胞的分离纯化以及组织细胞蛋白与核酸提取等实验中红细胞的去除。经红细胞裂解液裂解得到的组织细胞中不含红细胞,可进一步用于原代培养、细胞融合、流式细胞分析、核酸与蛋白的分离和提取等。
但是裂解后红细胞碎片较多,不易去除。
2.低渗裂解法
利用细胞渗透作用原理,细胞在低浓度缓冲液中会渗透吸水导致红细胞破裂,而白细胞相对红细胞有一定的耐受压,可以达到分离的目的。但是低渗法也能对白细胞有一定损伤,会对后续功能实验有影响。
3.密度梯度离心
常用的两种介质是Ficoll和PercollTM 。Ficoll是蔗糖的多聚体,常用于外周血单个核细胞的分离。Percoll是二氧化硅胶体颗粒,可形成连续和不连续两种梯度,主要能分离细胞,亚细胞结构和病毒的分离。密度梯度离心分离能更好的去除杂细胞获取目的细胞,且不会损伤细胞在下游分析中的功能或性能;常用于分选及功能实验;该方法效果好但是耗费时间长。
全血样本经细胞提取后用于下游实验时, 的细胞计数是细胞实验中至关重要的一步。因此需要对总的有核细胞和活细胞都要进行计数。虽然台盼蓝染色法是常用的活细胞计数方法,但是对于含有红细胞、血小板和杂质的样本,台盼蓝染色法不能区分计数有核细胞、红细胞和杂质。如果想快速 计数有核细胞且进行 细胞活力分析,那么Countstar双荧光AO/PI细胞计数法必不可少,它能保证计数结果的准确性和重复性。
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