一般描述
胶原酶D是通过过滤、硫酸铵沉淀、透析和冻干而从溶组织梭菌的培养物中制备的。
特异性
胶原酶可降解天然胶原蛋白。梭菌蛋白酶、胰蛋白酶样酶和中性蛋白酶也会降解其他蛋白质。
应用
来自溶组织梭菌的胶原酶被广泛用于解聚多种类型的组织(如,肺、心脏、肌肉、骨骼、脂肪组织、肝脏、肾脏、软骨、乳腺、胎盘、血管、脑、肿瘤),以及用于建立原代细胞培养系统的单细胞悬浮液的制备。当细胞表面蛋白的功能性和完整性很重要时,推荐使用胶原酶D。来自Roche的
梭菌胶原酶已用于从多种类型的组织中进行细胞的制备,如肝细胞、脂肪细胞、胰岛、上皮细胞、肌肉细胞、内皮细胞等。[1] [2] [3] [4] 然而,应根据经验确定每个批次的酶对破坏特定组织的适用性。
单位定义
来自Roche的胶原酶以W??nsch单位(在+25°C下每分钟用W??nsch底物形成μmol的产物)进行测定。
通常,胶原酶活性是以Mandl单位(在+37℃下5小时内从胶原释放的1 μmol亮氨酸)给出的。
不幸的是,两个活性单位之间没有统一的转换因子,因为Mandl单位部分取决于胶原酶制剂中污染性蛋白酶的浓度,而这是一个不确定的变量。较纯的胶原酶制剂相对于粗制剂在Mandl单位中实际上具有更低的比活性。梭菌制剂通常具有约1:1800的转换因子(如某个特定批次的梭菌胶原酶所含有的约0.15 W??nsch U/mg和250 Mandl U/mg)。
制备说明
激活剂:Ca2+
工作浓度:0.5 - 2.5mg/ml
储存条件(工作溶液):-15至-25°C
Roche建议仅重悬需要立即使用的冻干粉的量。重新配制的溶液可以在-15至-25℃下储存长达一周。因为重新配制后活性降低了,所以要避免反复冻融。
抑制剂:
胶原酶抑制剂:EDTA, EGTA, Cys, His, DTT, 2-巯基乙醇
胶原酶不会被血清所抑制。
梭菌蛋白酶抑制剂:TLCK
胰蛋白酶抑制剂:抑肽酶,胰蛋白酶抑制剂(蛋清,大豆)
酶活:
胶原酶活性:>0.15 U/mg (基于Wünsch) (+25°C, 4-苯基-偶氮苄基-氧基羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg作为底物)
污染性酶活:胰蛋白酶,梭菌蛋白酶和总蛋白水解活性
胶原酶D具有正常至高的胶原酶活性,以及非常低的胰蛋白酶活性(通常<0.2单位/mg,BAEE作为底物)。