链脲佐菌素 (Streptozotocin，STZ)-糖尿病动物模型造模

链脲佐菌素（英语：Streptozotocin或Streptozocin，简称STZ，又名链佐星、链脲霉素）是一种由链球菌产生的，对哺乳动物胰脏中产生胰岛素的胰岛B细胞有着特异毒性的天然化合物。它被用于临床上 胰岛细胞瘤，以及在医学研究中建立I型糖尿病的动物模型。

用途

链脲佐菌素被美国食品药品监督管理局批准用于 由转移引起的胰岛癌。由于STZ毒性较大且极少 癌症，它通常仅被用于那些无法通过手术 癌症的病人。对于这些病人，STZ可以使肿瘤缩小以及缓解症状（尤其是胰岛素瘤细胞产生的过量胰岛素引起的低血糖）。 典型的药用剂量为每天静脉注射500 mg/m2，持续5天，且每4~6周重复一次。因其对胰岛B细胞的高毒性，链脲佐菌素还在科学研究中长期用于在实验动物身上引发胰岛炎和糖尿病。

作用机理

链脲佐菌素是一种氨基葡萄糖—亚硝脲化合物。同其他亚硝脲类烷基化抗肿瘤剂一样，它透过损害DNA对细胞产生毒性，除此之外还有其他协同的机理。DNA的损害会引起ADP核糖基化，而这点很有可能比DNA损害本身对于糖尿病的引发发挥了更重要的作用。链脲佐菌素与葡萄糖分子具有足够的相似度，以至于葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）会将其转运至细胞中；然而其他葡萄糖转运蛋白并不能识别STZ。而胰岛B细胞含有大量的GLUT2，因此这点很好地解释了STZ对胰岛B细胞的特异毒性。

1. STZ诱发糖尿病动物模型的原理

STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物产生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造动物模型。I型糖尿病与II型糖尿病动物模型的制备与STZ注射的剂量有关系：大剂量注射时，由于直接引起胰岛β细胞的广泛破坏，可造成I型糖尿病模型；而注射较少量STZ时，由于只是破坏一部分胰岛β细胞的功能，造成外周组织对胰岛素不敏感，同时给予高热量饲料喂养，两者结合便诱导出病理、生理改变都接近于人类II型糖尿病的动物模型。国内外有学者报道选用雄性大鼠制造模型的成模率明显高于雌性大鼠。

2. 糖尿病模型动物的选择（体重、周龄、性别）

2.1  I型糖尿病（Type I diabetes）动物选择

一般按照体重选择即可，推荐大鼠170-200g，小鼠17-22g，适应性喂养1~2周后空腹注射STZ，成模率相对理想。【经验显示动物体重过高，比如当大鼠超过300g或小鼠超过35g，对STZ的耐药性加强，成模率随之降低。不建议使用超重的动物建模。】建议全部选择雄性动物，除非是实验方案有特定要求。有研究显示，雌性动物成模率差，而且可能会比雄性出现更高死亡率，尤其是I型。

2.2  II型糖尿病（Type II diabetes）动物选择

对于大鼠（比如SD/Wistar），选取4-5周龄，体重在90-100g，高脂（高糖）饲料喂养4-6周体重约达240-280g。 对于小鼠（比如C57/ICR/昆明小鼠），选取4-5周龄，体重在16-20g，高脂（高糖）饲料喂养4-6周体重约达30-35g。 对于新购入动物或更换饲养环境需要先用普通饲料适应性喂养一周，然后再选择适合周龄/体重动物转用高脂高糖饲料继续喂养。从模型建立成功率来看，大鼠推荐用SD，小鼠推荐C57。 建议全部选择雄性动物，除非是实验方案有特定要求。

3. STZ给药前动物的喂养

3.1 I型糖尿病模型：因成模比较快，通常动物在普通饲料适应性喂养1-2周后即可开始造模。

3.2 II型糖尿病模型：高脂高糖喂养诱导加小剂量STZ。造模前喂以高脂（高糖）饲料4-6周，诱发出胰岛素抵抗，再注射STZ。

4. 高脂（高糖）饲料

高脂（高糖）饲料基本要求：含10%蔗糖，10%猪油，5%胆固醇。由基础维持饲料加蔗糖、炼猪油和蛋黄按比搭配制作高脂高糖饲料：其比例为猪油18 % 、蔗糖20 %、蛋黄3 %、基础饲料59 %。饲料的成分比不是 的，可为了迎合口感，根据动物爱好，增加一些成分如猪油或全脂奶粉。

5. 预实验的重要性

非常重要。实验时STZ的给药量应参照预实验的结果来确定，尽量不要盲目按照文献上或他人的给药量来直接使用。因为动物均重和空腹（低糖状态）抗药力、禁食时长、注射手法、以及之前饲养过程、测糖选时等都不相同，通过预实验来确定符合自己实验情况的给药剂量，才是 的。

6. 常用给药剂量（STZ）

动物体重不同，STZ给药量也不同。一般情况STZ剂量（mg/kg）高低和体重大小呈反比。

以1200g均重大鼠为例，I型糖尿病，可用70~65mg/kg一次性给药（或分次注射如35mg/kg，2次）。

以250g均重大鼠为例，II型糖尿病，先喂养4-8周的高脂（高糖）饲料，可用35~50mg/kg一次给药。

以20g均重小鼠为例，I型糖尿病，可用150-220mg/kg一次性给药（或分2次，100mg/kg）。

以30g均重小鼠为例，II型糖尿病，先喂养4-8周的高脂（高糖）饲料，可用70~120mg/kg一次给药。

给药剂量是影响成模率的 因素，以上仅做参考。具体剂量请通过预实验的结果来确定。

7. 一次给药和多次给药的选择

假如需要给药150mg/kg，可每次给药50mg/kg，连续给3次。需注意的是与一次给药（150mg/kg）相比，多次给药造成动物死亡率可能得到缓解，但STZ对胰岛细胞的破坏力不如一次给药明显。换句话说，多次给药可能减少死亡，但是一次注射 。建议根据动物品种和耐受能力来决定给药次数。目前大部分用户采用一次给药。

8. 多次给药方式的选择

大剂量STZ注射后，药力发挥主要集中在注射后的3-72h。如果采用多次给药，建议在2-72h内延续 次给药，目前大部分用户选择24h为给药周期居多。小剂量给药STZ，当使用剂量偏低（低于理想值），动物可能在 周出现血糖缓慢提升迹象，但随着血糖峰值放缓且后延，有出现血糖先高后低、最终回落的可能。 多次给药的总次数1-7次都有用过。总体上，1次和3次用的偏多。

9. 禁食和血糖的关系

禁食12h以上（一般过夜禁食，不禁水）。禁食的时间越长，STZ对胰岛β细胞的破坏力越明显，即药效越高。所以相对禁食时间延长，可以降低STZ的用量。

10. STZ注射液的配置

10.1  STZ溶液的选择

配制STZ选择的溶液推荐用柠檬酸缓冲液，此缓冲液的pH范围能很好的控制在4.2~4.5，STZ在此pH范围内药效 。当然，也可使用其他溶液比如醋酸等，但pH值不好控制。

10.2  柠檬酸缓冲液的配制

称取2.1g 柠檬酸（Mw: 210.14）加入双蒸水100mL充分溶解中配成A液；

称取2.94g 柠檬酸钠（Mw: 294.10）加入双蒸水100mL充分溶解中配成B液；

将A、B液按比例混合（1：1.32，也有按1:1），pH计测定并调节pH=4.2-4.5，用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除杂，即是配置STZ的柠檬酸缓冲液。根据实际需要等比缩小或放大配制，尽量现配现用以防止氧化引起pH漂移。

【注意事项】：

a) 如果缓冲液配好后pH值不在范围内如何调节？—偏酸用柠檬酸钠（或双蒸水）调整，偏碱用柠檬酸调整。

b）缓冲液是否需要过滤？—必须过滤，柠檬酸/柠檬酸钠属于AR级化学试剂，内含杂质和其他离子，会影响动物对STZ的吸收。特别是静脉注射，严格要求过滤。

c）缓冲液是否需要灭菌？—灭菌是否对实验结果产生影响，这个没有实际的数据。如果条件允许，静脉注射 灭菌（120℃，20min）；腹腔注射可做可不做。

d）缓冲液是否能储存再用？— 可以，但使用前需再次测pH值，确保合乎范围。建议现配现用。

11. STZ注射操作事宜

过夜禁食后称重，按动物数目和注射剂量来计算，称取所需的STZ（冻干粉），放到一干燥的无菌瓶内，用铝箔或锡箔纸包好。将柠檬酸缓冲液和装STZ的瓶子提前置于冰浴中，一起带到动物房。 按照1%（w/v）浓度加入适量的柠檬酸缓冲液溶解STZ，充分溶解。按照动物空腹体重注射相应体积的STZ， 需在30min内注射完毕。对于注射技术不是很熟练，建议两组交替注射，分组溶解STZ，比如10只鼠/组或15只鼠/组。

12. 注射时，推进速度与血糖关系

一般来说，推注速度快，更容易形成高血糖；推注速度慢，相对危险性较低。常规操作中多要求快速注射。当然，STZ剂量是决定血糖高低的主要因素。

13. 腹腔注射和静脉注射的区别

静脉注射（尾静脉注射）药物利用率高，与腹腔注射相比，可以节省药量，但操作起来不如腹腔注射方便。

14. 未达标模型如何补救

模型不达标者，稳定后补注STZ（以10mg-20mg/kg体重剂量腹腔注射，根据实际情况选择合适剂量）也可以成模。或者待血糖恢复正常后再按常规剂量注射。但想要达到理想的效果，往往是恢复到正常状态下重新造模。

15. 如何解决死鼠问题

鼠的个体差别和空腹（低血糖）抵抗力的差异而致死亡率的不同，开始死亡率高可能主要是血糖突然升高，鼠不适应，或发生了糖尿病酮症酸中毒(diabetic ketoacidosis, DKA)。要解决死鼠问题，可通过以下方式来降低或避免死亡：

a）一定要保证足够的饮水量（饮水量不足容易导致死鼠）。

b）高血糖和低血糖都会造成死鼠，避免死鼠可以通过注射胰岛素或暂时补糖，两种途径： 1）常见为血糖过高。使用补胰岛素法，补一些中效胰岛素，例如中性低精蛋白锌人胰岛素（诺和灵N），每次2-3个单位，过了3-5天，大鼠一般死亡率就低了；2）补糖法，禁食后的鼠，注射的时候已经处于低血糖状态，造模4小时后腹腔注射20%葡萄糖，可避免因注射时血糖过低引起的死鼠。

c）防止动物自相残杀。食物缺乏和供水不足的情况下，会互相撕杀、啃食同类,所以食物和饮水要供应充足, 是两路供应。

d）防止感染。糖尿病大鼠尿量多，垫料潮湿，需要勤换垫料，所以糖尿病鼠较其他鼠更易出现感染，特别是泌尿道感染和腹腔感染。腹腔注射、皮下注射及采血测血糖等侵入性操作前后，要注意消毒工作。如每次采血测血糖后可用四环素（或金霉素眼药膏）局部涂抹处理伤口预防感染。

16. STZ保存和称量注意事项

保存：STZ置于-20℃冻存，避光干燥，可稳定至少保存2年。【有数据测试取一瓶按要求保存12年的STZ样品，HPLC检测显示期内的α-anomer由原来的94.9%减低到94.7%，稳定性还是很理想的。】

称量：由于STZ比较容易受潮，在反复称量过程中很容易接触到空气中潮气，其受潮30min后会失效，这和注射时要求快速注射也是一个道理，STZ水溶液也不是很稳定。为此，尽量避免反复称量， 次使用本品可根据估算的单次用量分装（操作环境、盛装容器、分装工具都必须保证干燥）。分装后用封口膜密封瓶口。用铝箔纸或锡箔纸避光包好，放入干燥罐内（含干燥剂），-20℃冻存。

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经验交流：糖尿病动物模型造模故事【仅是个人经验，供经验交流用】

实战经验A:

不管是四氧嘧啶还是STZ 造模，造模后的饲养是关键，我们一天要给大鼠换水四至五次，饲料喂三至四次（每次喂足够饲料），换水是早上7：00一次，白天随时补足，晚上10：00再给足水和饲料。有些动物的状态不是很好，可能抢不到足够的饲料和饮水，所以在饲养笼里也要注意加入适当的饲料。为了给足饮水，我们在大鼠饲养笼上再加一个水瓶架，就是比普通的饲养笼要多一个饮水口和双倍水量。另外，光照也是影响糖尿病大鼠死亡的原因之一，光照不能太强烈， 不要有太阳光出现，如有窗户的房间要把窗户用纸糊起来。

我的经验是饲料要保持干燥，潮湿后长霉菌造模鼠易腹泻；正常鼠可饮自来水，而造模鼠要给烧开过的水，这样不容易感染；此外垫料必须一天换一次，室内要勤消毒。刚开始我都没注意这些方面，结果一个月死了13只，后来严格注意，近一个月一只未死。

死亡原因可能有以下几点:

1、大鼠太小,也就是大鼠体重不够，容易引起死亡。

2、不知道你用的是什么大鼠，SD？Wistar？如果是后者，死亡就更多了（只是个人经验，还没有得到具体实验的证实，仅作参考）。

3、还有就是在造模后一定要加足水和饲料，而且要注意大鼠的饲养环境，要保持尽量干净，光照不能太强（避免有太阳光）！

我认为在造模后24小时内死亡的主要原因是胰岛细胞破坏后胰岛素大量释放导致的低血糖而亡，你不妨拿少量大鼠作个预实验，测测血糖看看，解决的办法可在STZ注射后给予0.5％葡萄糖饮水。充足的饮水和保持饲料干燥是成模后减少死亡的方法。

成模标准：

1）首先关键是糖尿病模型成模与否的鉴定，不少报道称造模后血糖有波动，建议持续观察。建议检测点：10d、2w、3-4w、5w，以明确血糖变化，确定模型建立时间。——推断相关疾病成模时间

STZ造模后，明显血糖水平波动呈现3个时相，一时性高血糖（1-2h）、短暂低血糖（6-10h）、持续高血糖（>72h）。必须适当补给胰岛素和葡萄糖。

2）我也造了一批模型，雄性SD大鼠，体重控制180－200g，STZ用量60mg/kg，我的PH值没有像别的同学那样用酸碱仪测，只是用PH试纸而已。但是我觉得一周或十天成模的方法不可信，加预实验我做了80只SD大鼠，腹腔注射后十天成模率90％，2周左右成模了的大鼠大约有一半恢复，3－4周左右血糖又开始升高，大概5周左右，血糖开始稳定且比较稳定。血糖升高以后每天更换木糠，因为模型组尿量多，我经常是一天换两次，我的模型已经做了8周，而且每天灌喂，目前情况还好，暂时还没有死亡，而且我一直没有使用胰岛素。

实战经验B:

模型稳定性及持续时间:

1、WISTAR大鼠（雌雄各半），200-300克体重，STZ用量，60mg/Kg。溶液：柠檬酸缓冲液（0.1mol/l，PH4.5）。腹腔注射。

2、缓冲液新鲜配制，溶解STZ后立即注射，别耽误太久了，腹腔注射注意勿入脏器。

3、12小时后，出现多饮症状，部分的血糖开始升高，7天后血糖大于16.65约80%。十天后90%。

4、注射STZ后 天开始，每天换垫料，注意充足的水及饲料。

5、雄鼠血糖持续偏高，目前已经4个月了，很稳定。雌鼠血糖不稳定，在一个月左右时间，血糖明显恢复，大部分血糖下降到10左右，持续约一月，又开始上升，达到成模标准，此后比较稳定，

失败原因分析

10天还没有成模型，可能要考虑一下：

1、腹腔注射的技术，是否注射到肠子里了。

2、STZ的配制是否合适，用PH4.6左右的0.1M的柠檬酸缓冲液配制，现配现用，如果操作慢， 放在冰浴里。

3、注射STZ之前是否禁食了，应该禁食12h左右。建议，再观察3天，还是不成模型的话，重新注射一次。